引言

今年9月份的藥品集采中，降脂藥物阿托伐他汀競(jìng)爭(zhēng)激烈。未中標(biāo)藥企就地解散銷售隊(duì)伍的消息震動(dòng)業(yè)界。

試想，如果有一天，病人只需要每半年打一針，既不需要吃藥，也不需要節(jié)食，就能維持正常的體重和血脂。到那一天，現(xiàn)有的降脂藥物可能被淘汰，那又將是怎樣一番景象。隨著RNA藥物Inclisiran三期臨床的成功，這一天也許就在眼前了。

Inclisiran是由Alnylam開發(fā)后轉(zhuǎn)讓給The Medicines Company的一款靶向PCSK9的小干擾核酸（siRNA）藥物。PCSK9是人體變異自證的降脂靶點(diǎn)，已有兩款單抗藥物批準(zhǔn)上市。單抗藥物主要是通過抑制PCSK9蛋白與肝臟中低密度脂蛋白受體（LDLR）的結(jié)合發(fā)揮降脂作用，需要每月注射；而Inclisiran直接降解PCSK9的信使RNA，抑制PCSK9蛋白合成，只需每半年注射一次。多個(gè)臨床試驗(yàn)表明，Inclisiran降脂效果優(yōu)于單抗，且副作用與安慰劑相當(dāng)（1）。其療效和安全性如果在大規(guī)模人群中得到驗(yàn)證，極有可能帶來降脂的革命性療法，甚至實(shí)現(xiàn)在健康人群中模擬PCSK9變異，預(yù)防與高血脂相關(guān)的慢性疾病。正是如此，諾華先下手為強(qiáng)，已于11月25日宣布97億美元并購(gòu)The Medicines Company，將Inclisiran納入囊中。

早在2018年8月，F(xiàn)DA就批準(zhǔn)了第一個(gè)siRNA藥物Patisiran，用于治療神經(jīng)退行性疾病hATTR變性；2019年11月20日，又批準(zhǔn)了用于治療急性肝卟啉癥（AHP）的第二個(gè)siRNA藥物Givosiran。他們都是由Alnylam的siRNA技術(shù)平臺(tái)研發(fā)成功的罕見病藥物。使用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）技術(shù)遞送的Patisiran副作用比較明顯，注射前需要使用抗組胺藥物和激素預(yù)防過敏反應(yīng)。Givosiran和Inclisiran使用的則是更加安全的GalNAc偶聯(lián)技術(shù)。

Inclisiran如果最終獲批，標(biāo)志著siRNA藥物進(jìn)入對(duì)安全性要求高，但市場(chǎng)更大的慢病領(lǐng)域。命運(yùn)多舛的RNA藥物將真正迎來“王者歸來”的高光時(shí)刻。

RNA藥物的發(fā)展歷程

RNA很長(zhǎng)一段時(shí)間被認(rèn)為只是在基因與蛋白質(zhì)之間傳遞信息的分子。其實(shí)在生命起源之初，RNA才是唯一的生命分子，既可儲(chǔ)存信息，也具有酶的功能。億萬年的進(jìn)化和演變，才產(chǎn)生了DNA和蛋白分子（2）。毫不奇怪，RNA除了充當(dāng)?shù)鞍缀铣傻男攀梗╩RNA）外，還具有非常重要的調(diào)控功能，這樣的非轉(zhuǎn)錄RNA包括miRNA， siRNA，lncRNA，piwiRNA等等。其中，僅miRNA分子就有400多種，調(diào)控至少三分之一的人類基因。自1953年Watson-Crick發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，人們就產(chǎn)生了根據(jù)核酸包含的遺傳信息和堿基配對(duì)規(guī)律實(shí)現(xiàn)“程序化”制藥的夢(mèng)想。

在追求這個(gè)夢(mèng)想過程中，RNA藥物起步最早，種類包括反義核酸（ASO），小干擾核酸（siRNA），適配體（aptamer）,核內(nèi)小核酸（snRNA)，信使RNA（mRNA）等5種。最近有人將基因編輯工具比如GRISPR-Cas9包含的RNA分子也歸于RNA藥物之列。這樣，RNA藥物就可以全面覆蓋DNA，RNA和蛋白質(zhì)三大靶點(diǎn)類型。U1snRNA和基因編輯處于非常早期，下面以ASO，siRNA，aptamer和mRNA為重點(diǎn)，簡(jiǎn)單介紹RNA藥物的發(fā)展歷程。

1）反義核酸（ASO）藥物

1978年，哈佛大學(xué)科學(xué)家Zamecnik等人使用配對(duì)的核酸分子抑制RNA病毒的復(fù)制，第一次提出了反義核酸（ASO）的概念（3）。

當(dāng)時(shí)的想法比較簡(jiǎn)單，就是通過堿基配對(duì)，封堵DNA或者RNA的翻譯和轉(zhuǎn)錄。超出人們預(yù)期的是，ASO還可以招募RNase酶降解mRNA，干擾pre-mRNA的剪接，甚至還可以間接增強(qiáng)某些蛋白的表達(dá)。這些功能都可以被利用，設(shè)計(jì)針對(duì)各種靶點(diǎn)的ASO藥物，比如最近獲批的藥物Nusinersen和Eteplirsen就是通過調(diào)控RNA剪接發(fā)揮作用。

目前已有7款A(yù)SO藥物被批準(zhǔn)上市，兩款由Sarepta開發(fā)外，其余都來自ASO藥物的領(lǐng)先公司Ionis（表1）。

表1.上市的ASO藥物

反義核酸藥物一路走來，道路并不平坦。1998年，Ionis的第一款藥物Fomivirsen批準(zhǔn)上市，用于治療艾滋病人的眼部CMV病毒感染。因?yàn)榭笻IV藥物的快速發(fā)展，CMV感染的艾滋病人急劇減少，F(xiàn)omivirsen最終退出市場(chǎng)。時(shí)隔14年，Ionis推出治療家族性高血脂的APOB反義核酸藥物Mipomersen。可惜，由于肝毒性和流感癥狀，先是被歐洲拒絕批準(zhǔn)，后來美國(guó)市場(chǎng)也被小分子藥物L(fēng)omitapide取代，商業(yè)上又是一敗涂地。2016年，Sarepta開發(fā)的Eteplirsen是在DMD患者苦求下獲批的，被認(rèn)為療效證據(jù)不足，許多商業(yè)保險(xiǎn)機(jī)構(gòu)拒絕報(bào)銷，市場(chǎng)前景可想而知。

好在Ionis屢敗屢戰(zhàn)，最近相繼推出治療SMA的藥物Nusinersen, hATTR變性藥物Inotersen，以及治療家族性高乳糜微粒血癥（FAC）的藥物Volanesorsen。其中至少Nusinersen曾經(jīng)因?yàn)榀熜锰崆爸兄古R床試驗(yàn)，Inotersen則面臨副作用更小的siRNA藥物Patisiran的強(qiáng)勁競(jìng)爭(zhēng)。靶向APOC3的藥物Volanesorsen與諾華合作，在心血管領(lǐng)域已進(jìn)入二期臨床，能否與Inclisiran匹敵，讓人期待。就在昨天，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了Sarepta的第二款DMD藥物Golodirsen上市。

當(dāng)前，全球有超過50個(gè)ASO藥物處于臨床研究階段，治療領(lǐng)域覆蓋中樞神經(jīng)系統(tǒng)，心血管，抗感染和腫瘤等。曾經(jīng)被逼改名的Ionis注定成為未來的巨星，目前管線中擁有5個(gè)三期，16個(gè)二期，5個(gè)一期產(chǎn)品。其中一款治療糖尿病的二期產(chǎn)品GCGR反義核酸的中國(guó)權(quán)益轉(zhuǎn)讓給了國(guó)內(nèi)小核酸領(lǐng)軍企業(yè)瑞博生物。

2）小干擾核酸（siRNA）藥物

RNA藥物真正引起制藥界的重視，是因?yàn)橹Z獎(jiǎng)成果RNAi的發(fā)現(xiàn)。1990年，美國(guó)亞利桑那大學(xué)的植物學(xué)家Jorgensen希望培育五顏六色的牽牛花，于是嘗試將深紫色的色素基因插入到植物當(dāng)中。讓人意想不到的是，他只得到了不含色素的白花，檢查發(fā)現(xiàn)色素基因的表達(dá)大大降低了。這個(gè)現(xiàn)象讓人百思不得其解，因此Jorgensen等人提出了一個(gè)所謂基因“共抑制”概念。

后來，Ambrose和Kemphues等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)RNA可以抑制基因的表達(dá)，即所謂的RNA干擾現(xiàn)象（RNAi）。1998年AndrewFire和CraigMello 揭示了RNAi的工作機(jī)制（5）。

RNAi現(xiàn)象其實(shí)是一種降解mRNA的后轉(zhuǎn)錄基因沉默（PTGS）。雙鏈RNA在胞質(zhì)中可以被核酸內(nèi)切酶Dicer切割成多個(gè)小片段（21～23 bp，即siRNA）。siRNA再與體內(nèi)解旋酶等結(jié)合形成沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC誘導(dǎo)降解與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的mRNA。RNAi現(xiàn)象高度保守，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于多種真核生物中。之前提到了植物中的基因共抑制也是因?yàn)槿斯まD(zhuǎn)錄基因過程中意外產(chǎn)生的siRNA所介導(dǎo)的干擾現(xiàn)象。

RNAi的特異，高效和簡(jiǎn)便性使得siRNA迅速成為最流行的基因調(diào)控工具。2001年，RNAi技術(shù)被《科學(xué)》雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一。2002年斯坦福大學(xué)的Mark Kay在Nature上發(fā)文證明人工合成的siRNA可以在小鼠上有效敲低目標(biāo)基因的表達(dá)，這讓制藥界意識(shí)到siRNA在臨床應(yīng)用的可能性。2003年，RNAi被美國(guó)財(cái)富雜志稱為價(jià)值億萬美金的生物科技突破。這一年，正值DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)50周年，還發(fā)生了一件里程碑事件：人類基因組項(xiàng)目宣布完成。后基因組時(shí)代和RNAi技術(shù)的突破，讓人們覺得“程序化”制藥的夢(mèng)想即將實(shí)現(xiàn)。

先前成立的，擁有大量專利的siRNA生物科技公司Alnylam和Sirna迅速成為跨國(guó)公司眼里的香餑餑。siRNA藥物的第一次繁榮在2006年達(dá)到高潮：當(dāng)年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了發(fā)現(xiàn)RNAi的Fire和Mello；默沙東用11億美金收購(gòu)了Sirna；武田，羅氏和諾華紛紛與Alnylam簽署巨額合同。

可惜好景不長(zhǎng)，在隨后的幾年內(nèi)siRNA藥物由于遞送和免疫反應(yīng)的問題屢遭挫折。2010年，先是諾華和羅氏中止與Alnylam的合作，隨后輝瑞和雅培中止了自己的RNA項(xiàng)目。默沙東堅(jiān)持多年，于2014年將Sirna以低于原收購(gòu)價(jià)20%的價(jià)格賣給了Alnylam。這些動(dòng)作被媒體放大后，業(yè)界普遍認(rèn)為siRNA只能作為研究工具，成藥的希望渺茫。

具有諷刺意味的是，大公司放棄這些資產(chǎn)時(shí)，正是siRNA技術(shù)取得突破并重新崛起的時(shí)候。比如2010年加州理工大學(xué)的一項(xiàng)研究證明siRNA人體有效，并能夠進(jìn)入腫瘤組織（7）。2013年，Alnylam公司在新英格蘭雜志上發(fā)表了patisiran安全有效的臨床數(shù)據(jù)（8）。當(dāng)然也有慧眼，Arrowhead從2011年到2015年借機(jī)收購(gòu)了大量別人放棄的RNA資產(chǎn)。Alnylam和Dicerna等公司也沒有放棄，通過裁員等措施度過了最艱難的時(shí)期。

在Alnylam等公司的努力下，siRNA藥物目前已有兩個(gè)上市，至少5個(gè)處于三期，9個(gè)二期，8個(gè)一期（表2）。自2018年起，大公司又開始大肆收購(gòu)siRNA資產(chǎn)，代表性Deal如表3所示，預(yù)示著siRNA藥物迎來了第二次浪潮。

表2：上市和處于三期的siRNA藥物

表3：最近的siRNA Deals

3）核酸適配體藥物（Aptamer）

在RNA藥物里，Aptamer算是一個(gè)異類。因?yàn)樗麄儾皇峭ㄟ^堿基配對(duì)來發(fā)揮作用，而是類似于蛋白質(zhì)，依靠自身的三維結(jié)構(gòu)與配體結(jié)合。

1990年8月份，美國(guó)Colorado大學(xué)和麻省總醫(yī)院的科學(xué)家分別在Science和Nature發(fā)表文章，顯示通過體外進(jìn)化和篩選，可以得到與目標(biāo)分子緊密結(jié)合的RNA分子，親合力和特異性與單抗相當(dāng)（9，10）。

他們把這個(gè)篩選過程叫做”Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment（SELEX）”。而Aptamer這個(gè)名字則是來自拉丁文字“aptus”，意思是“to fix”，中文翻譯成適配體。

SELEX符合適者生存的進(jìn)化原理，RNA文庫(kù)與靶標(biāo)孵育一定時(shí)間后，未結(jié)合的分子被移除，而結(jié)合的分子洗脫后經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增形成新的化合物庫(kù)，重復(fù)上述過程，經(jīng)過8-20輪篩選，一般能得到高特異性和高親和力的適配體。這個(gè)方法也適應(yīng)于DNA適配體的篩選。基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展大大加速了適配體的發(fā)現(xiàn)，而且這些適配體還可以進(jìn)一步進(jìn)行化學(xué)修飾，目前學(xué)術(shù)報(bào)道的用于治療和診斷的適配體超過1000個(gè)。

適配體作為藥物也有過榮光時(shí)刻，2004年FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)適配體藥物Pegaptanib，靶向VEGFR，用于治療老年黃斑病變（AMD）?？上А凹壬?何生瑜”，那時(shí)也正是單抗技術(shù)飛速發(fā)展的時(shí)代。FDA同年批準(zhǔn)了治療腫瘤的VEGFR單抗Avastin，處方外可以用來治療AMD，療效和安全性優(yōu)于Pegaptanib。2006年更優(yōu)的，治療AMD的Lucentis上市，Pegaptanib淘汰出局。隨后，F(xiàn)ovista（anti-PDGF）和Reg1（anti-FIXa）兩款臨床階段的適配體藥物相繼失敗，Reg1甚至造成了一個(gè)病人死亡（PEG過敏），適配體逐漸被工業(yè)界邊緣化。

理論上，適配體免疫原性小，易于合成，靶點(diǎn)范圍廣，甚至能夠結(jié)合活性細(xì)胞，也能靶向細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)，還是有不少獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。然而，隨著單抗技術(shù)的成熟，大公司已經(jīng)沒有興趣進(jìn)行大的投入。有意思的是，長(zhǎng)期研究適配體，從學(xué)術(shù)界轉(zhuǎn)行到工業(yè)界的科學(xué)家Matthew Levy于2018年發(fā)表綜述文章，從另一個(gè)角度審視了適配體領(lǐng)域衰退的原因（11）。

他認(rèn)為學(xué)術(shù)不端造成適配體研究結(jié)果不可重復(fù)，是藥物臨床失敗和工業(yè)界放棄該領(lǐng)域的一個(gè)重要原因。Levy試驗(yàn)室用FCS技術(shù)重復(fù)了大量文獻(xiàn)報(bào)道的適配體分子，相當(dāng)一部分根本不可重復(fù)。聯(lián)系文章作者，經(jīng)常得到的回復(fù)是“你們?cè)囼?yàn)做得不對(duì)”。指望這種只在自己手里工作的分子將來變成一個(gè)藥物，Levy認(rèn)為是在愚弄自己。

Levy指出還有很多試驗(yàn)室專注于表型研究，而不愿意花時(shí)間驗(yàn)證適配體本身與靶點(diǎn)的結(jié)合是否可靠，而很多時(shí)候，觀察到的表型是其他原因造成的。更有甚者，為了發(fā)文章而罔顧科學(xué)事實(shí)。比如AS1411是一款結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原nucleolin的抗癌藥物。研究表明，AS1411雖然結(jié)合nucleolin，但是不能造成nucleolin內(nèi)吞，但是仍有大量通過AS1411/nucleolin遞送藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的文章發(fā)表。Levy呼吁，適配體是好的藥物分子，但研究領(lǐng)域需要改變，提高結(jié)果的可重復(fù)性，讓工業(yè)界重拾信心。中國(guó)科研誠(chéng)信問題最近成為熱點(diǎn)，Levy提到的這些教訓(xùn)尤為應(yīng)景，值得思考。

4）信使RNA(mRNA)藥物

1961年，在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)8年之后，Brenner等人發(fā)現(xiàn)DNA和蛋白質(zhì)之間原來還有“中間人”，即mRNA（12）。沒有這個(gè)中間人，基因這個(gè)生命的藍(lán)圖除了一串化學(xué)符號(hào)之外什么都不是。mRNA的結(jié)構(gòu)，功能和代謝立即成為研究的熱點(diǎn)。

1990年，威斯康辛大學(xué)科學(xué)家首次證明，在動(dòng)物上直接注射體外轉(zhuǎn)錄的mRNA可以表達(dá)蛋白（13）。1992年，美國(guó)Scripps研究所的一項(xiàng)工作展現(xiàn)了mRNA治療疾病的潛力，他們通過腦內(nèi)注射Vasopressin mRNA，成功緩解了大鼠的尿崩癥（14）?？上?，在隨后的20年內(nèi)，這是唯一的，mRNA作為蛋白替代療法的嘗試。主要是由于mRNA穩(wěn)定性和免疫原性問題，人們把注意力更多地放在體外穩(wěn)定的plasmid DNA上。然而，人們逐漸發(fā)現(xiàn)DNA作為藥物，問題也很多。比如，藥物需要入核，還容易造成基因插入突變等。隨著化學(xué)改造和藥物傳遞技術(shù)的發(fā)展，RNA藥物的穩(wěn)定性和免疫原性逐漸得到克服（15），mRNA作為藥物的優(yōu)點(diǎn)和潛力慢慢展現(xiàn)。

首先，mRNA雖然是核酸分子，但與DNA不一樣，他們的作用是暫時(shí)的，完成工作后即被降解，造成基因突變的風(fēng)險(xiǎn)很??；

第二，一旦靶點(diǎn)確定，mRNA藥物的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)幾乎是程序化的，無需費(fèi)時(shí)費(fèi)力；

第三，堿基及其類似物，RNA合成酶和固相合成設(shè)備的商業(yè)化讓mRNA的合成變得簡(jiǎn)便。生產(chǎn)成本也大為下降。有專家估計(jì)，在當(dāng)前的技術(shù)水平下，mRNA藥物的生產(chǎn)成本是單抗的十分之一左右。這些特點(diǎn)讓mRNA的研發(fā)和生產(chǎn)的速度大大加快。2013年，中國(guó)爆發(fā)禽流感，中國(guó)疾控中心公開病毒基因序列后第8天，諾華疫苗部門就完成了一個(gè)mRNA疫苗的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，創(chuàng)造了一個(gè)目前還無人打破的紀(jì)錄（16）。這種速度完全可以與病毒變異保持同步，有望徹底解決棘手的耐藥問題。

第四，一個(gè)mRNA藥物可以同時(shí)表達(dá)多種蛋白，這為多價(jià)疫苗，比如腫瘤個(gè)性化疫苗，以及多蛋白聯(lián)合用藥提供了獨(dú)特的便利性。這個(gè)特點(diǎn)甚至可以用來設(shè)計(jì)自我復(fù)制的mRNA藥物組合，也就是靶點(diǎn)mRNA加全套復(fù)制蛋白的mRNA。受制于遞送效率， mRNA分子只有極少（0.01%）能成功進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并表達(dá)蛋白，因此需要大劑量給藥，帶來副作用。藥物自我復(fù)制的功能有望幫助降低給藥劑量。

第五，ex-vivo細(xì)胞治療的應(yīng)用。電轉(zhuǎn)等技術(shù)使得體外遞送mRNA進(jìn)入細(xì)胞變得十分便利。將靶細(xì)胞經(jīng)體外導(dǎo)入mRNA操作后，再回輸病人體內(nèi)，可以避開直接給藥的困難。還可以利用mRNA重編程，體外產(chǎn)生用于治療的iPSC干細(xì)胞。最后，只要遞送技術(shù)允許，mRNA幾乎可以在任何組織或細(xì)胞，表達(dá)任何蛋白，包括基因編輯工具TALEN和Cas9等。這樣CRISPR-Cas9就可以變成一種真正意義上的RNA藥物組合，包括sgRNA和Cas9mRNA。

mRNA藥物理論上可以覆蓋包括單抗，細(xì)胞治療和基因編輯在內(nèi)的所有當(dāng)前最熱門的新技術(shù)。有這樣的故事，就不難理解為什么2010年成立的，聚焦mRNA技術(shù)的Moderna會(huì)成為Biotech歷史上最大的IPO。截止今年4月份，Moderna累計(jì)募資19億美元，估值已超過50億美元。對(duì)于這樣一個(gè)沒有任何臨床數(shù)據(jù)出來biotech，投資者的厚愛讓人瞠目結(jié)舌。

表4. Moderna的管線(摘自公司官網(wǎng))

但是世界上恐怕沒有比生物科技翻臉更快的了，從高峰到低谷，有時(shí)就在一夜之間，只需一個(gè)病人的意外死亡。mRNA技術(shù)目前還處于非常早期。分子量大，以及蛋白翻譯機(jī)器對(duì)于去免疫原性和增加穩(wěn)定性所必須的化學(xué)改造容忍度低等原因，讓mRNA藥物的發(fā)展滯后于小核酸藥物ASO和siRNA。

mRNA領(lǐng)域發(fā)展得比較順利的還是疫苗的開發(fā)，這有幾個(gè)原因：1）疫苗所要求的蛋白表達(dá)量比較低；2）mRNA的免疫反應(yīng)一定程度度上有利于疫苗的效果；3）抗原遞呈的DC細(xì)胞天生善于吸收各種外來分子，有利于藥物的吸收；4）ex-vivo免疫細(xì)胞治療積累的經(jīng)驗(yàn)比較多。蛋白替代療法發(fā)展就相對(duì)難一些。除了前面提到的遞送和免疫等因素外，還要一個(gè)很重要的原因就是很多蛋白只有正確的折疊，切割，修飾和分泌后才能發(fā)揮正常的功能，而這些轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)，有時(shí)是組織或者細(xì)胞類型依賴的。也就是mRNA需要正確地遞送到特定的組織或細(xì)胞里，目前的技術(shù)水平還很難達(dá)到。另外，治療蛋白的表達(dá)量要求高，這意味著大劑量給藥，制劑輔料以及化學(xué)改造后非天然核酸的副作用難以克服。還要，mRNA本身不是治療分子，需要體內(nèi)“生產(chǎn)”蛋白后起作用，其藥代動(dòng)力學(xué)比單抗類蛋白藥物更加復(fù)雜，個(gè)體差異更大，難以控制(17)。

推動(dòng)RNA藥物發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)

RNA藥物的潛力巨大，但要進(jìn)入體內(nèi)卻要面臨進(jìn)化了數(shù)億年，大自然設(shè)計(jì)的防火墻：1）核酸的分子量和負(fù)電荷讓其不能自由通過生物膜；2）RNA容易被血漿和組織中RNase酶降解，被肝臟和腎臟快速清除和被免疫系統(tǒng)識(shí)別；3）進(jìn)入細(xì)胞后“卡”在內(nèi)吞小體中無法發(fā)揮功能。

所以半個(gè)世紀(jì)以來，RNA藥物發(fā)展面臨的技術(shù)障礙一直沒有變，那就是藥物遞送。解決遞送有兩個(gè)思路，一個(gè)是改造核酸分子，讓其穩(wěn)定并躲避免疫系統(tǒng)的識(shí)別；另外一個(gè)就是利用藥物傳輸系統(tǒng)，比如說脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和GalNAc偶聯(lián)技術(shù)。

1）核酸分子的化學(xué)改造(Chemical Modification)

如圖1所示，核酸分子的化學(xué)改造按部位分三類：堿基，糖環(huán)和連接基團(tuán)磷酸的改造。改造的核酸分子需要考慮多方面的性質(zhì)，主要包括穩(wěn)定性，藥代性質(zhì)，堿基配位親和力，避開免疫系統(tǒng)但確保能夠被功能酶所識(shí)別，因?yàn)锳SO, siRNA和mRNA等藥物都需要在各種酶（RNase, Ago2 and RNA Polymerase）的作用下才能發(fā)揮作用。到目前為止，最具突破性的改造是磷酸連接基團(tuán)中的一個(gè)氧（PO）換成硫（PS）和糖環(huán)2位修飾。

德國(guó)Max-Planck研究所的科學(xué)家在1966年第一次合成報(bào)道了PS核酸分子，并意外發(fā)現(xiàn)一個(gè)原子的改變使得核酸分子可以抵抗酶的降解（18）。雖然穩(wěn)定性也很重要，但PS對(duì)核酸藥物最大影響其實(shí)是因?yàn)榱蛟拥氖杷栽黾恿怂幬锏难獫{蛋白結(jié)合，從而大大改善了核酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。50多年過去了，雖然有大量的其他嘗試，但PS仍然是核酸藥物中最常用的磷酸連接基團(tuán)。

PS提高了穩(wěn)定性，但卻降低了核酸分子堿基配位的親和力。因?yàn)檫@個(gè)原因，第一代ASO藥物需要大劑量反復(fù)給藥，缺點(diǎn)明顯，其他改造變得非常必要。這次，老天爺給了些提示。我們知道，RNA分子中糖環(huán)的2位是羥基（OH），而DNA的2位沒有取代基。早在50年代，人們就發(fā)現(xiàn)在自然界存在微量的2位是甲氧基（OCH3）的核酸分子。這提示2位可能可以耐受化學(xué)改造。

過去30年，Ionis的化學(xué)家在2位改造做了大量工作，為核酸藥物的發(fā)展做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。目前，核酸藥物中2位最常見取代包括OCH3，F(xiàn)和MOE，其中MOE表現(xiàn)最為突出。糖環(huán)的改造還包括構(gòu)象鎖定類似物（locked nuclearacids, LNA）和嗎啉酰胺（PMO）等。這些改造提高了核酸分子的穩(wěn)定性和親和力，并可以維持酶識(shí)別所需的C3‘-endo構(gòu)象，以及RNA干擾中RISC識(shí)別所需的A-form雙螺旋結(jié)構(gòu)。

核酸藥物對(duì)堿基的改造耐受性較差。ASO和siRNA藥物中常見的改造有胞嘧啶的甲基化（5-methylcytosine）。mRNA藥物中的嘗試相對(duì)多一些，包括peudouridine,2-thiouridine, N6-methyladenosine以及各種堿基的5位甲基化。另外，mRNA轉(zhuǎn)錄需要5‘-capping，化學(xué)改造的cap類似物常用來提高蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。

RNA藥物是多個(gè)核酸分子組成的高分子，各種改造的數(shù)量和組合對(duì)分子的成藥性影響很大，比如一般認(rèn)為需要14個(gè)PS才能保證足夠的血漿蛋白結(jié)合。某個(gè)特定修飾可能造成酶識(shí)別能力的丟失。因此在藥物設(shè)計(jì)中，需要反復(fù)設(shè)計(jì)測(cè)試最合理的組合。有時(shí)還需保持一段天然的系列，比如ASO藥物中被RNase識(shí)別的Gapmer。核酸分子的單體改造與小分子藥物不同，如上所述，只有有限的改造空間，而且專利早已過期。因此不同改造的組合，對(duì)于IP的產(chǎn)生很重要，這對(duì)藥物開發(fā)至關(guān)重要。

圖1：核酸分子的化學(xué)改造

2）核酸藥物的遞送技術(shù)（Delivery Tech）

早期核酸的遞送主要是病毒載體，以及dextran等非病毒高分子材料。第一代載體的低效和免疫原性等缺點(diǎn)大大限制了核酸藥物的發(fā)展。

1987年，F(xiàn)elgner等發(fā)現(xiàn)帶正電荷的脂類分子如DOTMA形成的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle, LNP）能夠高效地轉(zhuǎn)染DNA，效率是dextran的5-100倍，被命名為“l(fā)ipofection”。隨后，通過添加輔助的其他類脂物質(zhì)如DOPE，得到進(jìn)一步改善的“l(fā)ipoplexes”。

然而，這些早期的陽離子LNP在體內(nèi)的應(yīng)用仍然受到很大限制，比如容易被巨噬細(xì)胞清除和產(chǎn)生有害的ROS等。為了解決這些問題，“可離子化“LNP的概念被提出。這些脂質(zhì)分子在體內(nèi)保持中性，從而避免被清除和帶來副作用，當(dāng)進(jìn)入強(qiáng)酸性環(huán)境如內(nèi)吞體，即可以質(zhì)子化形成陽離子從而與內(nèi)源的陰離子脂質(zhì)結(jié)合提高跨膜效率。經(jīng)過篩選，DODAP，DODMA，MC3等一系列可離子化LNPs被開發(fā)，從而真正解決了核酸藥物的臨床應(yīng)用障礙（圖2）。前面提到的第一個(gè)上市siRNA藥物Patisiran就是使用的MC3-LNP技術(shù)。

“可離子化”LNP雖然大大促進(jìn)了核酸藥物的發(fā)展，但仍然不盡人意。納米顆粒的體積比較大，一般需要靜脈注射，只能有效進(jìn)入肝臟，脾臟和腫瘤等空隙較大的組織。另外，LNP的過敏反應(yīng)也比較嚴(yán)重，在注射之前需要使用抗組胺和激素藥物控制。這些缺點(diǎn)讓LNP藥物只適用于罕見病和癌癥等嚴(yán)重疾病。

近年來，ADC等偶聯(lián)靶向技術(shù)在藥物傳輸中得到廣泛應(yīng)用。核酸藥物中最先嘗試的是脂質(zhì)偶聯(lián)（lipidconjugation），比較常見的是與膽固醇偶聯(lián)。脂質(zhì)偶聯(lián)的RNA能夠形成類似于低密度脂蛋白（LDL）的聚合物，不但延長(zhǎng)了循環(huán)時(shí)間，而且能與LDL受體或者其他受體結(jié)合，通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。由于LDL受體在肝臟中高表達(dá)，脂質(zhì)偶聯(lián)藥物系統(tǒng)給藥也主要是靶向肝臟，但如局部注射，也能進(jìn)入皮膚，眼睛和大腦等組織。

讓人意外的是，通過偶聯(lián)技術(shù)，RNA藥物進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)常沒有功能。研究發(fā)現(xiàn)，主要是因?yàn)镽NA分子通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后，被“卡”在內(nèi)吞小體內(nèi)，只有約0.01%的分子能夠逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮功能。因此，內(nèi)吞小體逃逸（endosome escape）成為偶聯(lián)給藥的限速步驟。為了解決這個(gè)問題，Arrowhead的科學(xué)家做了一個(gè)非常有意思的嘗試。他們?cè)谶f送抗乙肝RNAi偶聯(lián)藥物時(shí)，同時(shí)給予一種從蜜蜂毒素中分離的，可以裂解內(nèi)吞體膜的多肽melittin，大大提高了RNA分子逃逸的比例。十分遺憾，可能是內(nèi)吞體的正常功能受到影響，melittin也帶來了不可耐受的毒性，Arrowhead停止了三個(gè)乙肝項(xiàng)目的臨床開發(fā)。

RNA偶聯(lián)藥物似乎走進(jìn)了死胡同。然而，天無絕人之路，一項(xiàng)叫做”GalNAc“的技術(shù)橫空出世，不但挽救了偶聯(lián)技術(shù)，還成為RNA藥物王者歸來的真正推手。雖然僅限于肝臟靶點(diǎn)，但GalNAc技術(shù)的優(yōu)勢(shì)顯露無遺：1）只需2-5mg/kg劑量；2）皮下給藥；3）一次給藥持續(xù)6個(gè)月以上；4）制劑簡(jiǎn)單穩(wěn)定性好。諾華97億美元收購(gòu)的降脂藥物Inclisiran就是使用的GalNAc技術(shù)，安全性和便利性甚至超越了口服小分子。

神奇的發(fā)現(xiàn)一般源于意外，GalNAc也不例外。1965年，美國(guó)NIH的教授Gilbert Ashwell來到紐約哥倫比亞大學(xué)進(jìn)修。閑暇之時(shí)經(jīng)常去拜訪他的好朋友，在Albert Einstein醫(yī)學(xué)院做研究的Anatol Morell教授。Morell當(dāng)時(shí)正在研究糖蛋白ceruloplasmin的代謝，但苦于沒有辦法測(cè)試它的半衰期。做多糖出身的Ashwell建議他用酶剪切水楊酸后，用放射性元素標(biāo)記糖蛋白末端的乳糖(Glactose)。他們發(fā)現(xiàn)這種放射性物質(zhì)注射到兔子體內(nèi)，5分鐘就從血漿中消失了，幾乎100%聚集在肝臟中（20）。

從這開始，他們發(fā)現(xiàn)肝臟中存在一種識(shí)別乳糖的受體，最后鑒定為哺乳動(dòng)物中的第一個(gè)凝集素蛋白Lectin，并被命名為Ashwell-Morell受體（AMR）。糖蛋白或者表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞暴露末端乳糖即會(huì)被AMR回收進(jìn)入肝臟。每個(gè)肝細(xì)胞所含AMR超過50萬個(gè)，這些受體結(jié)合乳糖及其類似物后內(nèi)吞，內(nèi)吞體中的酸性環(huán)境讓其釋放貨物并recycle至細(xì)胞表面，這個(gè)過程大約只需15分鐘。

早在1971年，AMR就被聰明的科學(xué)家利用進(jìn)行靶向肝臟的藥物傳輸（21）。隨后，各種乳糖類似物包括親合力最強(qiáng)的GalNAc被發(fā)現(xiàn)可以與AMR結(jié)合，并可以用做偶聯(lián)載體，遞送包括小分子，多肽，蛋白和核酸之內(nèi)的各種藥物進(jìn)入肝臟。1995年，GalNAc被發(fā)現(xiàn)可以有效遞送核酸分子（22）。GalNAc的數(shù)量，linker及連接方式對(duì)遞送效率的影響得到了廣泛的研究。2015年，Alnylam科學(xué)家證明GalNAc-siRNA偶聯(lián)藥物可以在小鼠和猴子中抑制抗凝血酶的表達(dá)，顯示了治療血友病的潛力（23）。

圖2：核酸藥物的遞送技術(shù)

雖然有扎實(shí)的基礎(chǔ)研究，GalNAc-RNA藥物的臨床研究并不是一帆風(fēng)順，差點(diǎn)胎死腹中。Alnylam的第一個(gè)GalNAc-siRNA臨床候選藥物Revusiran，靶向hTT基因，用于治療退行性疾病ATTR。Revusiran二期臨床12個(gè)月降低血漿TTR水平達(dá)90%，卻不明原因增加病人的死亡率，導(dǎo)致2016年試驗(yàn)中止。

分析發(fā)現(xiàn)，死亡原因可能是這款RNA藥物的穩(wěn)定性不夠，需要大劑量給藥，而經(jīng)化學(xué)改造的非天然核酸分子大劑量下可能帶來毒性。Alnylam隨后推出了更加穩(wěn)定的所謂“ESC“化學(xué)骨架（包含2’-OMe/F;PS），成功地解決了這個(gè)問題。第二代anti-TTR產(chǎn)品一年的用量只需100mg， 而第一代Revusiran需要28g，劑量降低了280倍，療效和安全性大為改善。

最近幾年，基于GalNAc的技術(shù)平臺(tái)層出不窮，比如Alnylam的ESC，Dicerna的GalXC和Arrowhead的TRiM等。GalNAc-RNA藥物已迎來蓬勃發(fā)展的時(shí)期，至少9個(gè)GalNAc-ASO產(chǎn)品處于臨床階段（表5）；GalNAc-siRNA發(fā)展更為迅速，僅三家公司Alnylam，Dicerna，和Arrowhead產(chǎn)品線即包括一個(gè)上市產(chǎn)品（Givosiran），2個(gè)三期，4個(gè)二期和7個(gè)一期產(chǎn)品（表6）。

表5：GalNAc-ASO藥物

表6：GalNAc-siRNA藥物

RNA藥物的未來發(fā)展方向

RNA藥物近年來獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，已有7個(gè)ASOs，2個(gè)siRNA和1個(gè)Aptamar上市，超過50個(gè)處于臨床的各個(gè)階段。Inclisiran明年可能上市，成為第一個(gè)進(jìn)入慢病市場(chǎng)的RNAi藥物。取得這樣的成績(jī)是過去50年化學(xué)，生物和遞送技術(shù)積累的結(jié)果。未來發(fā)展方向，可以分為科技和商業(yè)二個(gè)方面?？萍嫉闹攸c(diǎn)是如何突破肝臟以外的靶器官，這其中的關(guān)鍵是破解內(nèi)吞體逃逸（endosome escape）的機(jī)制，而商業(yè)上最大的看點(diǎn)是RNA藥物能否帶來真正的“單病人”時(shí)代。

1）RNA藥物科技的發(fā)展方向

RNA藥物發(fā)展的一個(gè)最大障礙是靶點(diǎn)局限在肝臟。雖然通過局部注射，在眼睛和中樞神經(jīng)等其他組織也有成功案例，但療效和安全性都不盡如人意。繼續(xù)改造核酸分子的化學(xué)骨架，以及優(yōu)化核酸系列的排列組合，針對(duì)不同靶點(diǎn)選擇合適的鏈結(jié)構(gòu)，顯然是持續(xù)努力的方向，但改善的空間十分有限。

突破肝臟局限最大的希望還在于遞送技術(shù)的發(fā)展，包括改善LNP的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)，國(guó)內(nèi)mRNA領(lǐng)先企業(yè)斯微生物的Core-Shell雙層遞送系統(tǒng)就是一個(gè)很好的例子。但終極解決這個(gè)問題的關(guān)鍵可能在于破解內(nèi)吞體逃逸的機(jī)制。

前面提到，內(nèi)吞體逃逸是RNA藥物發(fā)揮作用的最后一道坎。如果能夠提高目前0.01%逃逸率的一個(gè)百分點(diǎn)，藥物劑量即可大大降低，很多當(dāng)前困擾RNA藥物的問題可以迎刃而解，比如制劑和非天然核酸的副作用，免疫反應(yīng)等。GalNAc偶聯(lián)技術(shù)就是一個(gè)例子。GalNAc在RNA藥物上獲得巨大成功，除了肝靶向外還大大提高了RNA的逃逸率。不幸的是，我們并不知到為什么。有人猜測(cè)是其受體AMR快速 recycle需要高頻率打開內(nèi)吞體膜，給了RNA分子逃逸的機(jī)會(huì)。在不知道機(jī)制的情況下，GalNAc就只能是一個(gè)意外，它的成功不可復(fù)制。因此，理解生物膜的結(jié)構(gòu)和調(diào)控規(guī)律，破解內(nèi)吞體逃逸機(jī)制是促進(jìn)RNA藥物發(fā)展亟待解決的科學(xué)難題。

當(dāng)然，發(fā)現(xiàn)更多肝臟高表達(dá)，疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，短期里也許更切合實(shí)際。乙肝和NASH等肝病重癥顯然是優(yōu)先發(fā)展的領(lǐng)域。深入理解RNA的生物學(xué)也是推動(dòng)領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵因素，這些RNA既可以是靶點(diǎn)比如致病miRNA和lncRNA等，也可以是藥物本身。

另外，促進(jìn)蛋白表達(dá)的，非mRNA藥物發(fā)展相對(duì)滯后，比如ASO，以及華人科學(xué)家李龍承教授發(fā)現(xiàn)的RNAa等（24）。外源性mRNA有其局限性，比如有時(shí)不能被正確折疊和修飾，因此提高內(nèi)源蛋白表達(dá)的RNA“激動(dòng)劑”有獨(dú)特的價(jià)值。第一個(gè)RNAa藥物已進(jìn)入臨床研究，通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CEBPA治療肝癌。相信，隨著遞送技術(shù)的完善，該類藥物還有很大的提升空間。

最后，拓展RNA藥物的應(yīng)用范圍?；蚓庉嫻ぞ逤RISPR-Cas9的核心部件是sgRNA，Rarkau等2019年報(bào)道了一種靶向sgRNA的核酸藥物，可以抑制CRISPR-Cas9的功能，將來也許可以用作基因編輯的解毒劑（25）。

2）RNA藥物帶來“單病人”時(shí)代

今年2月份，52歲的美國(guó)黑色素瘤晚期病人Brad Kremer遇到了一個(gè)“要命”的麻煩。他的一個(gè)從德國(guó)來的包裹被扣在海關(guān)，里面是生物科技公司Bio NTech為他量身定做的腫瘤個(gè)性化疫苗BNT122。好事多磨，三個(gè)禮拜后他收到包裹并注射了疫苗，隨后早已擴(kuò)散的腫瘤在他身上慢慢消失了。腫瘤個(gè)性化疫苗已經(jīng)帶有“單病人”的特點(diǎn)，因?yàn)檫@些疫苗是根據(jù)病人所特有的腫瘤新生抗原所設(shè)計(jì)的mRNA，每個(gè)病人的藥物獨(dú)一無二。

“單病人”這個(gè)概念是今年10月份新英格蘭雜志報(bào)道Mila的案例后，F(xiàn)DA兩位主任Dr.Woodcock和Dr.Marks在同期雜志上發(fā)表評(píng)論時(shí)提出來的（26）。

2017年，6歲的小女孩Mila被診斷患有罕見疾病“Batten’ disease”，是由于基因MFSD8插入SVA變異造成的。如果沒有治療，女孩很快將會(huì)因?yàn)榇竽X退化而死。波士頓兒童醫(yī)院的Dr.Tiothy Yu為她設(shè)計(jì)了一款靶向SVA的反義核酸藥物，取名”Milasen”，并委托CRO公司完成了定制合成。

通過與FDA的反復(fù)溝通，F(xiàn)DA第一次批準(zhǔn)了為單個(gè)病人研發(fā)的藥物進(jìn)入臨床研究。Mila注射“Milasen”后，癥狀得到了控制。FDA兩位高管提出了一系列“單病人”時(shí)代所面臨的監(jiān)管挑戰(zhàn)，比如有效的客觀性，安全性的最低要求，批準(zhǔn)臨床需要什么證據(jù)，緊迫性對(duì)監(jiān)管做決定的影響，產(chǎn)品特征的要求，劑量和用藥方案，持續(xù)生產(chǎn)的問題，以及其他倫理和社會(huì)問題。

但一旦開了先河，就很難停止。在病人家屬的強(qiáng)烈要求下，Dr.Yu目前正在計(jì)劃為一名患有Ataxia telangiectasia的嬰兒開發(fā)反義核酸藥物。

Mila(right)，from Science

“單病人”是個(gè)性化藥物，或者說是精準(zhǔn)醫(yī)療的極致，這個(gè)時(shí)代的開啟顯然是因?yàn)楹怂崴幬锏募夹g(shù)發(fā)展所推動(dòng)的。當(dāng)前技術(shù)水平條件下，siRNA藥物的一年用藥量可以降到100mg以下，給藥頻率每年二次。mRNA和ASO等藥物的設(shè)計(jì)在計(jì)算機(jī)輔助下，幾乎是分分鐘的事情。委托CRO公司生產(chǎn)十分便利，費(fèi)用也不高。稍微麻煩一點(diǎn)的是制劑的研發(fā)和藥物的優(yōu)化測(cè)試。隨著技術(shù)的發(fā)展，這些環(huán)節(jié)也極有可能模塊化。

大數(shù)據(jù)，基因測(cè)序，人工智能和3D打印技術(shù)必將進(jìn)一步推動(dòng)核酸藥物和“單病人”時(shí)代的發(fā)展。試想一下，將來的一天，你感到不舒服，智能手機(jī)抽取一滴血，分析發(fā)現(xiàn)你的某個(gè)基因或者蛋白不妥，指令發(fā)給一臺(tái)藥物設(shè)計(jì)，合成和組裝一體化的3D打印設(shè)備，1個(gè)小時(shí)后你就拿到了你自己的藥物，用藥后疾病一次治愈，終身不再發(fā)作。如果不是人體生物這個(gè)黑洞，這個(gè)夢(mèng)想從藥物技術(shù)上看并不遙遠(yuǎn)。

結(jié)語

幾十億年前，是核酸分子孕育了生命。今天，人類面臨諸多重大疾病的威脅，解鈴還須系鈴人，基因治療和RNA藥物的發(fā)展，從深層次上顯得非常自然和諧。

下個(gè)十年，核酸藥物有望成為繼小分子和單抗之后的第三大類型藥物，中國(guó)有沒有機(jī)會(huì)，就看我們的科研，監(jiān)管，資本，和市場(chǎng)能不能形成一個(gè)創(chuàng)新生態(tài)。在這個(gè)生態(tài)下，像Ionis和Alnylam這樣的公司，30年如一日，可以屢敗屢戰(zhàn)，經(jīng)歷幾起幾落，最后王者歸來。

中國(guó)創(chuàng)新藥面臨所謂的醫(yī)保懸崖，有人說me-too新藥難做了，急需轉(zhuǎn)向原始創(chuàng)新和原創(chuàng)技術(shù)。大方向沒有錯(cuò)，但從RNA藥物的發(fā)展歷程來看，原創(chuàng)更難，風(fēng)險(xiǎn)很大。如果，我們不能接受或者無法承受失敗，不要輕言從跟隨向原創(chuàng)的轉(zhuǎn)型。

作者/謝雨禮博士

編輯/同寫意@Jingyu

（滑動(dòng)可瀏覽）

參考文獻(xiàn)：

1）BioDrugs, Nov 28th2019

2）Gilbert, W. Nature319, 618 (1986)

3）Zamecnik andStephenon. PNAS, 1978, 75, 285

本文轉(zhuǎn)自“同寫意”。